關于非釀酒酵母在葡萄酒中的研究
摘 要：目前，葡萄釀酒酵母菌的研究不再局限于釀酒酵母菌，非釀酒酵母的釀酒特性研究等研究成為國內外近年來的研究熱點。非釀酒酵母是一類自然存在于葡萄酒發(fā)酵中的微生物，其代謝物對葡萄酒的香氣和風味等感官特點有著重要的影響。該文綜述了非釀酒酵母在葡萄酒生產中的研究進展，以期對我國葡萄酒釀造提供參考。
關鍵詞：非釀酒酵母菌；香氣；釀造；混菌發(fā)酵
1前言
葡萄酒的文章來源華夏酒報釀造本質上是一個微生物作用的過程，這些微生物中最主要的是酵母菌。
由于來自于葡萄及釀酒環(huán)境中的酵母菌具有多樣性，因此葡萄汁發(fā)酵是由酵母菌群體相互作用引起的。
葡萄酒生產中除了釀酒酵母（Saccharomyces）外，主要的非釀酒酵母（non-Saccharomyces）有克勒克酵母（Kloeckera）、梅氏酵母（Metschnikowia）、漢生酵母（hansenula）、有孢漢生酵母（Hanseniaspora）、假絲酵母（Candida）、接合酵母（Zygosaccharomyces）和酒香酵母（Brettanomyces）等。
在發(fā)酵過程中，非釀酒酵母與釀酒酵母一起消耗營養(yǎng)物質并產生二級代謝物，同時其具有一定的果膠酶、葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白質水解酶和尿酶活性，從而影響葡萄酒的發(fā)酵風味。
非釀酒酵母普遍的特點是不耐高濃度的酒精、對SO2 較敏感，并且會產生高濃度的乙酸和乙酸乙酯。
早先，非釀酒酵母并不被看好用于葡萄酒的生產，但是最近幾十年來，國內外通過對優(yōu)良酵母的篩選和特性研究，以及通過改良技術對優(yōu)良酵母菌的改良，篩選培育出了能夠滿足消費者口味的特色菌株。
這些菌株逐漸被應用于葡萄酒的生產，以提高酒的特色風味和總體風味，使酒的風味特征得到了明顯改善。目前，非釀酒酵母已經引起了研究人員的極大關注。
2非釀酒酵母的研究進展概況
對于葡萄釀酒酵母資源的相關研究，早期主要是以釀酒酵母為主。
近年來, 研究者們除了側重于釀酒酵母菌系的多樣性、葡萄釀酒酵母菌與葡萄酒風味的關系、不同菌株對葡萄酒香氣的影響及合成與代謝的研究之外，也注意到了除了釀酒酵母以外的其他屬、種的酵母菌對于地區(qū)特色品種的葡萄的特色風味的影響。
非釀酒酵母由于參與葡萄酒發(fā)酵的代謝過程，每個不同的種都以特異性的代謝活動為特征，對于葡萄酒的質量和風味，特別是香氣質量具有非常重要的影響。
國外學者對產香和產酒酵母在葡萄酒生產上的研究和應用都比國內要早許多，并且率先研究產香和產酒酵母的連續(xù)混合培養(yǎng)發(fā)酵。
西班牙的J.M.emente-Jimenez等為改進酒中芳香化合物和酒質，分離出耐酒力的畢赤氏酵母S. cerevisiae 和產芳香物質多的酵母Pichia fermentans，通過連續(xù)混合培養(yǎng)發(fā)酵生產干白葡萄酒，其研究結果表明：Pichia fermentans在制酒工業(yè)上是一種很好的起始菌株，通過連續(xù)混合發(fā)酵，僅僅在兩天之內，就能夠得到足夠（質量和數量上）的必需芳香物質。這是對產香酵母和產酒酵母進行連續(xù)混合發(fā)酵成功的一次報道。
3非釀酒酵母在葡萄酒中的存在情況
盡管至今為止世界各地所發(fā)現的與葡萄酒相關的酵母種類是相似的，但是受到氣候因素的影響，在不同的地區(qū)，各種酵母菌的比例和數量有著明顯的不同。
如在降雨量大的地區(qū)，葡萄成熟時非釀酒酵母的數量會增加。
研究人員普遍認為，葡萄園中最多的是檸檬克勒克酵母（K. apiculata）和葡萄汁有孢漢生酵母（Hanseniaspora uvarum），占分離菌株的50%~75%。
而在炎熱地區(qū)的葡萄園中，葡萄汁有孢漢生酵母（Hanseniaspora uvarum）為主要菌種。
如果在寒冷地區(qū)的葡萄園中，檸檬克勒克酵母（K. apiculata）則會占大多數。
在中等氣候地區(qū)，檸檬克勒克酵母（K. apiculata）和葡萄汁有孢漢生酵母（Hanseniaspora uvarum）這兩種非釀酒酵母的數量則大致相當。
在經常使用殺蟲劑和其他化學藥劑的產區(qū)，酵母菌的數量也會有所變化。
在沒有使用化肥的葡萄園中，釀酒酵母菌的數量較多，而某些殺蟲劑能刺激檸檬克勒克酵母（K. apiculata）生成更多的酒精，在一定程度上也增加了其他代謝物的產生。
由上述內見可見，地理位置、氣候和土壤環(huán)境對酵母是有影響的。
葡萄酒相關酵母廣泛地存在于葡萄園、葡萄表皮、酒廠的生產設備等環(huán)境中，通過壓榨過程進入葡萄漿中。
在自然發(fā)酵早期，經常會發(fā)現克勒克酵母、有孢漢生酵母、紅酵母、畢赤酵母、假絲酵母（星形假絲C.stellata、鐵紅假絲C.pulcherrima、清酒假絲C.sake）和隱球酵母等，但含量相對較少，為103cfu/mL~106cfu/mL，其中檸檬克勒克酵母最多，其次是假絲酵母。
當達到發(fā)酵中期，酒精度為5%vol~8%vol時，有的酵母數量開始下降，生長受到抑制。有一些非釀酒酵母可以一直存活到發(fā)酵第12天，而有的可以貫穿整個發(fā)酵期，細胞數為106cfu/mL~108cfu/mL，星形假絲酵母、星形球擬酵母可耐受12%vol的酒精。
而發(fā)酵結束的酒中，只有一小部分非釀酒酵母存在，如酒香酵母、德克酵母（Dekkera）、拜耳結合酵母（Z.bailii）、膜醭畢赤酵母（P. membranifaciens）、克柔假絲酵母（C. krusei）和粗狀假絲酵母（C. valida）。其中，酒香酵母和接合酵母是和釀酒酵母一樣耐受酒精的，通過過濾方可去除。但是大部分非釀酒酵母在葡萄漿發(fā)酵旺盛的時候消失了，因為其生長相對緩慢，又受到了葡萄漿的滲透壓、低pH值、氧氣缺乏和乙醇含量升高的影響，同時營養(yǎng)的限制和釀酒酵母的接種量也抑制了非釀酒酵母的存活。
掌握非釀酒酵母特性，適當調整和改變釀造工藝條件，可以大幅度提高非釀酒酵母的存活率，進而改變葡萄酒的最終質量。
4非釀酒酵母菌在葡萄酒中的作用
葡萄汁的發(fā)酵前期存在大量非釀酒酵母屬的酵母，其中檸檬形酵母（ Hansenula uvarum & Kloeckera apiculata）是主要菌種，細胞濃度可達106~107 個細胞/mL。
而在發(fā)酵末期，酒香酵母（Brettanomyces ）、克魯維酵母（ Kluyveromyces）、裂殖酵母（ Schizosaccharomyces ）、有孢圓酵母（ Torulaspora）、接合酵母（ Zygosaccharomyces ）及釀酒酵母（ Saccharomycodes）等屬的酵母也可檢測到。這些菌的活動對葡萄酒的化學成分和最終感觀具有重要影響。
早期的研究認為，非釀酒酵母屬酵母，耐酒精能力弱，發(fā)酵力低，僅能產生3% ~ 5% ( VPV) 的乙醇，存活時間短，同時產生大量的醋酸，因此，一直被列入葡萄酒釀造的有害菌種之中。
但是，近期的大量研究發(fā)現，非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過程中具有比原來認為的更加有意義的作用。
非釀酒酵母與釀酒酵母相比，可以產生和分泌多種胞外酶。膠質酶可增加葡萄汁的提取，促進酒的澄清。
B-糖苷酶是水解的非揮發(fā)性的糖苷香氣物質前體，蛋白酶能增加澄清，酯酶是重要的發(fā)酵香氣成分，脂肪酶能分解葡萄或酵母自溶的脂肪。這些酶與葡萄汁相互作用，展現并產生不同的品種和發(fā)酵香氣。
B-糖苷酶在葡萄酒釀造中具有重要的作用，它能夠水解葡萄酒中以糖苷鍵結合的非揮發(fā)性風味前提物，釋放出風味活性物質。與漿果本身的葡萄糖苷酶相比，酵母的糖苷酶不受葡萄糖的抑制。
人們發(fā)現一些種屬如假絲酵母、克勒克酵母或有孢漢遜酵母可以通過代謝和自溶來提高葡萄酒的香氣，參與復雜新鮮的風味物質的形成。
野生酵母能生成酯類、高級醇、甘油、醛和琥珀酸等影響葡萄酒感官特點的重要成分。目前, 星形假絲酵母（Candida stellata）和戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii ）已是公認的對葡萄酒感官特征具有積極影響的菌種。
1998年, Ciani 等人在對五種非釀酒酵母的釀酒特性的研究中指出C.stellata具有持續(xù)高產甘油的特性，其平均甘油產量可達11176gPL。
同時，T.delbrueckii也是經常存在于酒廠環(huán)境中的酵母，早在1954 年,Castelli就指明該菌具有極高的發(fā)酵純度，因此曾作為發(fā)酵的啟動菌。
此外,該菌的其它酒精發(fā)酵特性也對葡萄酒的感官具有積極的作用。
檸檬型的kloeckera apiculata（ H .uvarum） 由于產生過多的醋酸和乙酸乙酯，以及低的酒精產量，一般認為是對葡萄酒質量不利的菌種。
然而,Roman（2003）發(fā)現有很大數量的H .uvarum 酵母的產醋酸能力低于1gPL，可以用于與釀酒酵母混合發(fā)酵。
Ciani（1998）也曾在自然葡萄汁中發(fā)現低產醋酸的K . apiculata的菌株。
此外， K .apiculata菌的醋酸和乙酸乙酯的產量均與其乙醇產量反相關。因此對于葡萄酒感官結構具有很好的平衡作用。
5混菌發(fā)酵
當前葡萄酒生產多選用釀酒酵母，優(yōu)點是發(fā)酵快、成品酒穩(wěn)定性高、質量一致。
而非釀酒酵母在葡萄酒生產中完全發(fā)酵的能力不夠，產酒精的能力也稍差。
但是非釀酒酵母具有很多對葡萄酒感官有利的影響，同時也存在一些消極作用。
因此，如果能夠充分的利用兩大類酵母的特點和優(yōu)勢，尤其是發(fā)酵早期的非釀酒酵母和釀酒酵母的相互作用，進行混和或順序接種發(fā)酵，會使葡萄酒具有更加復雜的口感和香氣，也可以改善單一菌種所帶來的不良影響。
采用混合發(fā)酵，使不同的菌種取長補短，也是當前的一個研究熱點。
Nathalie moreria 等（ 2005 ）對H . uvarum，H .guilliermondii 和S. cerevisiae 的純種發(fā)酵及混合發(fā)酵進行了研究。
他們發(fā)現，其中H .guilliermondii具有最高的生長力，同時也是最佳的2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的產生者，并且不受其他菌的影響。
用釀酒酵母和H . guilliermondii混合發(fā)酵最顯著的特征是2-苯乙醇和2-乙酸苯乙酯的明顯增加，其中2-苯乙醇可達613mgPL， 而在單純的釀酒酵母發(fā)酵中產生的2-苯乙醇不超過1112mgPL。2-乙酸苯乙酯只存在于H .guilliermondii的發(fā)酵基質中，可達1111mgPL,而一般的釀酒酵母僅可產生0122~0125mgPL。這些物質可賦于葡萄酒果香與花香。
6展望
隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用基因工程改造非釀酒酵母獲得具有新的理想特征的各種酵母菌種，釀造具有復雜口感、風格獨特的葡萄酒將會成為現代葡萄酒產業(yè)發(fā)展的重要方向。
國內的葡萄酒生產中廣泛使用活性干酵母進行發(fā)酵，這不僅使產品的同質化加劇，也會抑制自然界中的釀酒酵母及其它野生酵母的進化發(fā)展，同時又浪費了大自然給予我們的寶貴財富。
因此, 加強葡萄酒相關酵母的研究及非釀酒酵母的利用對我國葡萄酒的良性發(fā)展具有十分重要的意義。
