關(guān)于非釀酒酵母在葡萄酒中的研究
摘 要：目前，葡萄釀酒酵母菌的研究不再局限于釀酒酵母菌，非釀酒酵母的釀酒特性研究等研究成為國(guó)內(nèi)外近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。非釀酒酵母是一類自然存在于葡萄酒發(fā)酵中的微生物，其代謝物對(duì)葡萄酒的香氣和風(fēng)味等感官特點(diǎn)有著重要的影響。該文綜述了非釀酒酵母在葡萄酒生產(chǎn)中的研究進(jìn)展，以期對(duì)我國(guó)葡萄酒釀造提供參考。
關(guān)鍵詞：非釀酒酵母菌；香氣；釀造；混菌發(fā)酵
1前言
葡萄酒的文章來(lái)源華夏酒報(bào)釀造本質(zhì)上是一個(gè)微生物作用的過(guò)程，這些微生物中最主要的是酵母菌。
由于來(lái)自于葡萄及釀酒環(huán)境中的酵母菌具有多樣性，因此葡萄汁發(fā)酵是由酵母菌群體相互作用引起的。
葡萄酒生產(chǎn)中除了釀酒酵母（Saccharomyces）外，主要的非釀酒酵母（non-Saccharomyces）有克勒克酵母（Kloeckera）、梅氏酵母（Metschnikowia）、漢生酵母（hansenula）、有孢漢生酵母（Hanseniaspora）、假絲酵母（Candida）、接合酵母（Zygosaccharomyces）和酒香酵母（Brettanomyces）等。
在發(fā)酵過(guò)程中，非釀酒酵母與釀酒酵母一起消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生二級(jí)代謝物，同時(shí)其具有一定的果膠酶、葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白質(zhì)水解酶和尿酶活性，從而影響葡萄酒的發(fā)酵風(fēng)味。
非釀酒酵母普遍的特點(diǎn)是不耐高濃度的酒精、對(duì)SO2 較敏感，并且會(huì)產(chǎn)生高濃度的乙酸和乙酸乙酯。
早先，非釀酒酵母并不被看好用于葡萄酒的生產(chǎn)，但是最近幾十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外通過(guò)對(duì)優(yōu)良酵母的篩選和特性研究，以及通過(guò)改良技術(shù)對(duì)優(yōu)良酵母菌的改良，篩選培育出了能夠滿足消費(fèi)者口味的特色菌株。
這些菌株逐漸被應(yīng)用于葡萄酒的生產(chǎn)，以提高酒的特色風(fēng)味和總體風(fēng)味，使酒的風(fēng)味特征得到了明顯改善。目前，非釀酒酵母已經(jīng)引起了研究人員的極大關(guān)注。
2非釀酒酵母的研究進(jìn)展概況
對(duì)于葡萄釀酒酵母資源的相關(guān)研究，早期主要是以釀酒酵母為主。
近年來(lái), 研究者們除了側(cè)重于釀酒酵母菌系的多樣性、葡萄釀酒酵母菌與葡萄酒風(fēng)味的關(guān)系、不同菌株對(duì)葡萄酒香氣的影響及合成與代謝的研究之外，也注意到了除了釀酒酵母以外的其他屬、種的酵母菌對(duì)于地區(qū)特色品種的葡萄的特色風(fēng)味的影響。
非釀酒酵母由于參與葡萄酒發(fā)酵的代謝過(guò)程，每個(gè)不同的種都以特異性的代謝活動(dòng)為特征，對(duì)于葡萄酒的質(zhì)量和風(fēng)味，特別是香氣質(zhì)量具有非常重要的影響。
國(guó)外學(xué)者對(duì)產(chǎn)香和產(chǎn)酒酵母在葡萄酒生產(chǎn)上的研究和應(yīng)用都比國(guó)內(nèi)要早許多，并且率先研究產(chǎn)香和產(chǎn)酒酵母的連續(xù)混合培養(yǎng)發(fā)酵。
西班牙的J.M.emente-Jimenez等為改進(jìn)酒中芳香化合物和酒質(zhì)，分離出耐酒力的畢赤氏酵母S. cerevisiae 和產(chǎn)芳香物質(zhì)多的酵母Pichia fermentans，通過(guò)連續(xù)混合培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)干白葡萄酒，其研究結(jié)果表明：Pichia fermentans在制酒工業(yè)上是一種很好的起始菌株，通過(guò)連續(xù)混合發(fā)酵，僅僅在兩天之內(nèi)，就能夠得到足夠（質(zhì)量和數(shù)量上）的必需芳香物質(zhì)。這是對(duì)產(chǎn)香酵母和產(chǎn)酒酵母進(jìn)行連續(xù)混合發(fā)酵成功的一次報(bào)道。
3非釀酒酵母在葡萄酒中的存在情況
盡管至今為止世界各地所發(fā)現(xiàn)的與葡萄酒相關(guān)的酵母種類是相似的，但是受到氣候因素的影響，在不同的地區(qū)，各種酵母菌的比例和數(shù)量有著明顯的不同。
如在降雨量大的地區(qū)，葡萄成熟時(shí)非釀酒酵母的數(shù)量會(huì)增加。
研究人員普遍認(rèn)為，葡萄園中最多的是檸檬克勒克酵母（K. apiculata）和葡萄汁有孢漢生酵母（Hanseniaspora uvarum），占分離菌株的50%~75%。
而在炎熱地區(qū)的葡萄園中，葡萄汁有孢漢生酵母（Hanseniaspora uvarum）為主要菌種。
如果在寒冷地區(qū)的葡萄園中，檸檬克勒克酵母（K. apiculata）則會(huì)占大多數(shù)。
在中等氣候地區(qū)，檸檬克勒克酵母（K. apiculata）和葡萄汁有孢漢生酵母（Hanseniaspora uvarum）這兩種非釀酒酵母的數(shù)量則大致相當(dāng)。
在經(jīng)常使用殺蟲劑和其他化學(xué)藥劑的產(chǎn)區(qū)，酵母菌的數(shù)量也會(huì)有所變化。
在沒(méi)有使用化肥的葡萄園中，釀酒酵母菌的數(shù)量較多，而某些殺蟲劑能刺激檸檬克勒克酵母（K. apiculata）生成更多的酒精，在一定程度上也增加了其他代謝物的產(chǎn)生。
由上述內(nèi)見(jiàn)可見(jiàn)，地理位置、氣候和土壤環(huán)境對(duì)酵母是有影響的。
葡萄酒相關(guān)酵母廣泛地存在于葡萄園、葡萄表皮、酒廠的生產(chǎn)設(shè)備等環(huán)境中，通過(guò)壓榨過(guò)程進(jìn)入葡萄漿中。
在自然發(fā)酵早期，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)克勒克酵母、有孢漢生酵母、紅酵母、畢赤酵母、假絲酵母（星形假絲C.stellata、鐵紅假絲C.pulcherrima、清酒假絲C.sake）和隱球酵母等，但含量相對(duì)較少，為103cfu/mL~106cfu/mL，其中檸檬克勒克酵母最多，其次是假絲酵母。
當(dāng)達(dá)到發(fā)酵中期，酒精度為5%vol~8%vol時(shí)，有的酵母數(shù)量開始下降，生長(zhǎng)受到抑制。有一些非釀酒酵母可以一直存活到發(fā)酵第12天，而有的可以貫穿整個(gè)發(fā)酵期，細(xì)胞數(shù)為106cfu/mL~108cfu/mL，星形假絲酵母、星形球擬酵母可耐受12%vol的酒精。
而發(fā)酵結(jié)束的酒中，只有一小部分非釀酒酵母存在，如酒香酵母、德克酵母（Dekkera）、拜耳結(jié)合酵母（Z.bailii）、膜醭畢赤酵母（P. membranifaciens）、克柔假絲酵母（C. krusei）和粗狀假絲酵母（C. valida）。其中，酒香酵母和接合酵母是和釀酒酵母一樣耐受酒精的，通過(guò)過(guò)濾方可去除。但是大部分非釀酒酵母在葡萄漿發(fā)酵旺盛的時(shí)候消失了，因?yàn)槠渖L(zhǎng)相對(duì)緩慢，又受到了葡萄漿的滲透壓、低pH值、氧氣缺乏和乙醇含量升高的影響，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)的限制和釀酒酵母的接種量也抑制了非釀酒酵母的存活。
掌握非釀酒酵母特性，適當(dāng)調(diào)整和改變釀造工藝條件，可以大幅度提高非釀酒酵母的存活率，進(jìn)而改變葡萄酒的最終質(zhì)量。
4非釀酒酵母菌在葡萄酒中的作用
葡萄汁的發(fā)酵前期存在大量非釀酒酵母屬的酵母，其中檸檬形酵母（ Hansenula uvarum & Kloeckera apiculata）是主要菌種，細(xì)胞濃度可達(dá)106~107 個(gè)細(xì)胞/mL。
而在發(fā)酵末期，酒香酵母（Brettanomyces ）、克魯維酵母（ Kluyveromyces）、裂殖酵母（ Schizosaccharomyces ）、有孢圓酵母（ Torulaspora）、接合酵母（ Zygosaccharomyces ）及釀酒酵母（ Saccharomycodes）等屬的酵母也可檢測(cè)到。這些菌的活動(dòng)對(duì)葡萄酒的化學(xué)成分和最終感觀具有重要影響。
早期的研究認(rèn)為，非釀酒酵母屬酵母，耐酒精能力弱，發(fā)酵力低，僅能產(chǎn)生3% ~ 5% ( VPV) 的乙醇，存活時(shí)間短，同時(shí)產(chǎn)生大量的醋酸，因此，一直被列入葡萄酒釀造的有害菌種之中。
但是，近期的大量研究發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中具有比原來(lái)認(rèn)為的更加有意義的作用。
非釀酒酵母與釀酒酵母相比，可以產(chǎn)生和分泌多種胞外酶。膠質(zhì)酶可增加葡萄汁的提取，促進(jìn)酒的澄清。
B-糖苷酶是水解的非揮發(fā)性的糖苷香氣物質(zhì)前體，蛋白酶能增加澄清，酯酶是重要的發(fā)酵香氣成分，脂肪酶能分解葡萄或酵母自溶的脂肪。這些酶與葡萄汁相互作用，展現(xiàn)并產(chǎn)生不同的品種和發(fā)酵香氣。
B-糖苷酶在葡萄酒釀造中具有重要的作用，它能夠水解葡萄酒中以糖苷鍵結(jié)合的非揮發(fā)性風(fēng)味前提物，釋放出風(fēng)味活性物質(zhì)。與漿果本身的葡萄糖苷酶相比，酵母的糖苷酶不受葡萄糖的抑制。
人們發(fā)現(xiàn)一些種屬如假絲酵母、克勒克酵母或有孢漢遜酵母可以通過(guò)代謝和自溶來(lái)提高葡萄酒的香氣，參與復(fù)雜新鮮的風(fēng)味物質(zhì)的形成。
野生酵母能生成酯類、高級(jí)醇、甘油、醛和琥珀酸等影響葡萄酒感官特點(diǎn)的重要成分。目前, 星形假絲酵母（Candida stellata）和戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii ）已是公認(rèn)的對(duì)葡萄酒感官特征具有積極影響的菌種。
1998年, Ciani 等人在對(duì)五種非釀酒酵母的釀酒特性的研究中指出C.stellata具有持續(xù)高產(chǎn)甘油的特性，其平均甘油產(chǎn)量可達(dá)11176gPL。
同時(shí)，T.delbrueckii也是經(jīng)常存在于酒廠環(huán)境中的酵母，早在1954 年,Castelli就指明該菌具有極高的發(fā)酵純度，因此曾作為發(fā)酵的啟動(dòng)菌。
此外,該菌的其它酒精發(fā)酵特性也對(duì)葡萄酒的感官具有積極的作用。
檸檬型的kloeckera apiculata（ H .uvarum） 由于產(chǎn)生過(guò)多的醋酸和乙酸乙酯，以及低的酒精產(chǎn)量，一般認(rèn)為是對(duì)葡萄酒質(zhì)量不利的菌種。
然而,Roman（2003）發(fā)現(xiàn)有很大數(shù)量的H .uvarum 酵母的產(chǎn)醋酸能力低于1gPL，可以用于與釀酒酵母混合發(fā)酵。
Ciani（1998）也曾在自然葡萄汁中發(fā)現(xiàn)低產(chǎn)醋酸的K . apiculata的菌株。
此外， K .apiculata菌的醋酸和乙酸乙酯的產(chǎn)量均與其乙醇產(chǎn)量反相關(guān)。因此對(duì)于葡萄酒感官結(jié)構(gòu)具有很好的平衡作用。
5混菌發(fā)酵
當(dāng)前葡萄酒生產(chǎn)多選用釀酒酵母，優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵快、成品酒穩(wěn)定性高、質(zhì)量一致。
而非釀酒酵母在葡萄酒生產(chǎn)中完全發(fā)酵的能力不夠，產(chǎn)酒精的能力也稍差。
但是非釀酒酵母具有很多對(duì)葡萄酒感官有利的影響，同時(shí)也存在一些消極作用。
因此，如果能夠充分的利用兩大類酵母的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，尤其是發(fā)酵早期的非釀酒酵母和釀酒酵母的相互作用，進(jìn)行混和或順序接種發(fā)酵，會(huì)使葡萄酒具有更加復(fù)雜的口感和香氣，也可以改善單一菌種所帶來(lái)的不良影響。
采用混合發(fā)酵，使不同的菌種取長(zhǎng)補(bǔ)短，也是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
Nathalie moreria 等（ 2005 ）對(duì)H . uvarum，H .guilliermondii 和S. cerevisiae 的純種發(fā)酵及混合發(fā)酵進(jìn)行了研究。
他們發(fā)現(xiàn)，其中H .guilliermondii具有最高的生長(zhǎng)力，同時(shí)也是最佳的2-乙酸苯乙酯和2-苯基乙醇的產(chǎn)生者，并且不受其他菌的影響。
用釀酒酵母和H . guilliermondii混合發(fā)酵最顯著的特征是2-苯乙醇和2-乙酸苯乙酯的明顯增加，其中2-苯乙醇可達(dá)613mgPL， 而在單純的釀酒酵母發(fā)酵中產(chǎn)生的2-苯乙醇不超過(guò)1112mgPL。2-乙酸苯乙酯只存在于H .guilliermondii的發(fā)酵基質(zhì)中，可達(dá)1111mgPL,而一般的釀酒酵母僅可產(chǎn)生0122~0125mgPL。這些物質(zhì)可賦于葡萄酒果香與花香。
6展望
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程改造非釀酒酵母獲得具有新的理想特征的各種酵母菌種，釀造具有復(fù)雜口感、風(fēng)格獨(dú)特的葡萄酒將會(huì)成為現(xiàn)代葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。
國(guó)內(nèi)的葡萄酒生產(chǎn)中廣泛使用活性干酵母進(jìn)行發(fā)酵，這不僅使產(chǎn)品的同質(zhì)化加劇，也會(huì)抑制自然界中的釀酒酵母及其它野生酵母的進(jìn)化發(fā)展，同時(shí)又浪費(fèi)了大自然給予我們的寶貴財(cái)富。
因此, 加強(qiáng)葡萄酒相關(guān)酵母的研究及非釀酒酵母的利用對(duì)我國(guó)葡萄酒的良性發(fā)展具有十分重要的意義。
